Фильм начинается флешбеком о том, как африканский лев Зуба пытается научить своего сына Алакая драться, но детеныш больше интересуется танцами. Соперник самец Макунга бросает вызов Зубе за титул альфа-льва, и сбежавший во время их боя Алакай попадает в плен к браконьерам. Ящик со львенком падает в океан и дрейфует в Нью-Йорк, где его называют Алексом и поселяют в Центральный парк вместе с зеброй Марти, жирафом Мелманом и бегемотом Глорией.

Действие переносится на годы вперед, возвращаясь к событиям первой части серии. В Мадагаскаре четверка главных героев готовится вернуться в Нью-Йорк на борту потрепанного самолета, пилотируемого пингвинами, в сопровождении лемуров Короля Джулиана, Мориса и Морта. Вскоре после начала полета у самолета заканчивается топливо, и он совершает аварийную посадку в Африке.

К счастью, самолет приземляется в заповеднике, и вскоре каждый герой встречает других представителей своего вида. Алекс воссоединяется со своими родителями и впечатляет их рассказами о своем статусе «короля Нью-Йорка»; Марти вступает в стадо других зебр, которые выглядят так же, как он; Мелман становится местным доктором, а Глория привлекает внимание импозантного бегемота Мото Мото.

Поначалу все они находятся в полном восторге от Африки, но скоро каждый из них начинает испытывать кризис собственной идентичности. Ситуация усложняется тем, что в заповеднике заканчивается вода, и все животные начинают страдать от жажды. Смогут ли герои сохранить свою дружбу и свои жизни в условиях засухи?

Юную Глорию, озвученную Джадой Пинкетт-Смит, играет ее дочь, а сын Бена Стиллера, озвучившего Алекса, играет его молодую версию.

Сцена, в которой Морт цепляется к крылу самолета, является отсылкой к одному из самых известных и пугающих эпизодов сериала «Сумеречная Зона: Кошмар на высоте 20 000 футов», классике хоррора шестидесятых.

Когда детеныш Алекс прибывает в Нью-Йорк в ящике, на горизонте города виднеются башни-близнецы Всемирного торгового центра, что позволяет предположить, что события происходят до теракта 11 сентября.

Сюжетная линия, в которой Мелман влюбляется, изначально должна была быть показана в первом «Мадагаскаре», но из-за нехватки хронометража мультфильма ее перенесли в продолжение. Кроме того, по сценарию первой части он должен был влюбиться в жирафу по имени Кики, но создатели мультфильма решили, что будет забавнее, если он полюбит Глорию.

В сцене, где командир пингвинов Шкипер говорит обезьяне, что хотел расцеловал бы ее, обезьяна отвечает: «Хорошо, хотя ты и страшненький». Это отсылка к роману Пьера Буля и его экранизации «Планета обезьян», где доктор Зира отвечает на просьбу Тейлора о поцелуе фразой: «Хорошо, но ты столь чертовски уродлив».

Имя бегемота «Мото Мото» на суахили означает «Горячий-горячий». Его финским дубляжом занимался Вилле Вало, солист группы HIM.

Когда Бабуля произносит свою мотивационную речь для других нью-йоркских туристов, заблудившихся в джунглях, в конце сцены ее тень напоминает Статую Свободы. Она даже держит в руках факел, а ее сумочка похожа на книгу.

Всех зебр в фильме озвучил Крис Рок, чтобы подчеркнуть тот факт, что даже их голоса точно такие же, как у Марти.

Изначально в фильме было еще больше сцен, в которых акула преследовала Морта по всей Африке, но режиссеры вырезали их из-за нехватки хронометража.

Основная сюжетная линия фильма навеяна одной из самых известных работ Disney, «Король лев»: это зависть Макунги к Зубе, являющемуся вожаком прайда, и узурпация им власти, которая плохо заканчивается для его подданных.

Оригинальное название мультфильма переводится как «Мадагаскар: Побег в Африку». Некоторые люди сомневались в названии, утверждая, что Мадагаскар уже является частью Африки. На самом деле это не так: Мадагаскар – автономный остров у побережья Африки, не входящий в Африканский союз.

Согласно звуковому комментарию к фильму, кукла хула, в которую влюбился Шкипер, носит имя Лола. Она была названа в честь персонажа из песни At the Copacabana, которая звучит в фильме в сцене, когда животные собираются разрушить речную дамбу.